Besinsel Lif Analizi Nasıl Yapılır?

Besinsel Lif Analizi

Kullanılan Kimyasallar

 

Toplam Besinsel Lif Kiti (Merck 1.12979) :

α -amylase çözeltisi  5 mL
Protease çözeltisi 5 mL
Amyloglucosidase çözeltisi 3x15 mL

 

MES/TRİS tamponu: 19.52 g  2(N-morfolin)etan sülfonik asit (MES) (Merck1.06126) ve 14.2g tris(hidroksimetil)aminometan (TRİS) (Merck1.08382) 1.7 L deiyonize suda çözülür. Çözeltinin pH’ sı 6 N NaOH ile 8.2’ ye ayarlanır. Çözeltinin son hacmi 2 L ye saf su ile tamamlanır.

0.561 N HCl asit çözeltisi: 700 mL saf su üzerine 93.5 ml 6 N HCl asit koyularak 1Lt ye tamamlanır.

%95‘ lik etil alkol :95 mL mutlak (Merck 1.00983) etanol üzerine 5 mL saf su eklenir

%78‘ lik etil alkol : 78 mL mutlak (Merck 1.00983) etanol üzerine 5 mL saf su eklenir

Aseton (Merck 1.00014)

Petrol Eteri (Merck 1.01775)

 

Kullanılan Malzemeler

• Falcon tüpü 50 mL
• Gooch krozesi
• Tüplük (50 mLFalcon tüpüne uygun)
• Su Banyosu
• Vakum pompası veya su trompu
• Erlen(250 mL)
• Nuche erleni
• Etüv
• Pipet (5,10 mL)
• Mikropipet (0-200µl aralığında) 
• Sarı pipet ucu
• Vorteks
   

Deneyin yapılışı

Eğer örnek %5 ten fazla yağ içeriyor ise örnekteki yağ uzaklaştırılır. Örnek 3 defa 25 mL petrol eteri ile çalkalanıp süzülür. Daha sonra elde edilen yağsız örnek 70 C°’ da 2-3 saat kurutulur. Yağsız örnek  boyutu 0.3-0.5 mm mesh olacak şekilde öğütülür.

Enzimatik parçalanma:

50 mL falcon tüplerine1 g örnek tartılır. Üzerine 40 mL MES/TRIS çözeltisi eklenerek çözelti vortexlenir.

50 µl α -amylase çözeltisi eklenir, vortexlenir, 95-100C° ‘da 30 dakika bekletilir. Çözelti 60 C°’a soğutulur.

50 µl protease çözeltisi eklenir, vortexlenir, 60 C°’da -  30 dakika bekletilir.

5 mL 0.561 N HCL eklenerek çözeltinin pH 4.1-4.8 aralığına getirilir.

150 µl amyloglucosidase çözeltisi eklenir, vortexlenir, 60 C° -  30 dakika bekletilir. 

Toplam Besinsel Lif analizi yapılıcak ise;

Enzimatik parçalanma işlemi bittikten sonra örnek bir erlene 60 C° sıcaklıktaki 220 mL etanol  ile yıkanarak aktarılır.

Çözelti ağzı kapatılarak 1 saat bekletir.

Vakum yardımı ile daha önce sabit tartıma getirilmiş gooch krozesinden süzlür

Çökelek %78’lik etanol (3x15 mL) , %95’lik etanol (2x10 mL) ve  aseton (3x10 mL) ile yıkanır.

105 C°’da 1 gece etüvde bekletilir.

Tartım alınır (m2)

Parallerden birinde kül (k), diğerinde protein (p) analizi yapılır.

 

Çözünen ve Çözünmeyen  Besinsel Lif analizleri yapılacak ise;

Amyloglucosidase enzimi eklenip 30 dakika beklendikten sonra çözelti daha önceden sabit tartıma getirilen gooch krozesinden süzülür. Çökelek 70 C° sıcaklıktaki saf su ile (2x10mL) yıkanır. Çökelek ile çözünmeyen besinsel lif, çözelti ile ise çözünen besinsel lif analizi yapılır.

 

Çözünen Besinsel Lif analizi;

Süzüntünün ağırlığı 80 g olana kadar saf su eklenir

Önceden 60°C’ye ısıtılmış % 95 ‘ lik 320 ml etanol eklenir

Çökme işleminin tamamlanması için 1 saat bekletilir.

Çözelti sabit tartıma getirilmiş gooch krozesinden (cam kroze) süzülür.

Çökelek %78 ‘lik etanolle (3x15 ml), %95’ lik etanolle (2x10 ml ) ve son olarak asetonla (3x10 ml ) yıkanır.

105 C°’da 1 gece etüvde bekletilir.

Tartım alınır (m3)

Parallerden birinde kül (k), diğerinde protein (p) analizi yapılır.

Çözünmeyen Besinsel Lif analizi;
Çökelek % 95’lik etanol ile (2x10mL) ve aseton ile (2x10mL) yıkanır.

105 C°’da 1 gece etüvde bekletilir.

Tartım alınır (m4)

Parallerden birinde kül (k), diğerinde protein (p) analizi yapılır.

Hesaplamalar

Kül ve protein deney sonuçları bazen negatif sonuc verebilir. Negatif değerler hesaplamalara katılmamalıdır.

% Toplam diyet lif = [(m2 - m1) -( k+ p ) x100] /  m

% Çözünmeyen Diyet Lif = [(m4 - m1) - ( k+ p ) x100] / m

% Çözünen Diyet Lif = [(m3 - m1) - ( k+ p ) x100] /  m

m: alınan örnek miktarı

 

Not: Analiz, örnek miktarı ve buna bağlı olarak kimyasalların miktarları 4 'e bölünerek yapılabilinir (denenmiştir). Hangi firmanın enzimleri kullanılacak ise enzim aktiviteleri nedeniyle enzim miktarları firmanın belirttigi miktarlarda kullanılmalıdır.  Protein analizi, sonucun genellikle 0 çıkması nedeniyle yapılmamaktadır.

 

* Test kiti içerisinde yer alan orjinal kullanma kılavuzunu aşağıdaki bağlantıdan indirebilirisiniz.