Lowry Metodu (folin Fenol Metodu) İle Protein Tayini

Lowry Metodu (Folin Fenol Metodu) ile Protein Tayini

Yöntemin Prensibi

Alkali ortamda bakır iyonu (Cu+2 ) proteinlerdeki peptid bağları ile bir kompleks oluşturur ve Cu+1 e indirgenir. İndirgenmiş bakır ve proteinlerin yan zincirinde yer alan Tyr, Trp ve Cys aminoasitleri Folin-Fenol reaktifini indirgeyerek renk oluşumuna neden olur olur. Oluşan rengin şiddeti protein konsantrasyonu ile doğru orantılıdır ve 660 nm’de spektrofotometrik olarak ölçülür.

Kullanılan Malzemeler ve Cihazlar

• Spektrofotometre
• Spektrofotometre küveti 
• Terazi
• Pipet (5 mL)
• Mikropipet (100-1000 µl)
• Pipet ucu (mavi)
• Falcon tüpü (15 mL)
• Vorteks
• Balonjoje( 100 mL, 1000 mL)

Kullanılan Kimyasallar

1. BSA (bovine serum albumin): Stok çözeltiden derişimi 0, 20, 40, 60, 80, 100 mg/L olan standart çözeltiler hazırlanır.
2. Çözelti A: 1000 ml damıtık sudaki 20 g Na2CO3, 4 g NaOH ve 1.6 g Na-K tartarat çözeltisi
3. Çözelti B:100 ml damıtık sudaki 4 g Cu2SO4.5H2O çözeltisi
4. Çözelti C: 100:1 (v/v) oranında çözelti A : çözelti B karışımı
5. Folin-Ciocalteu’s fenol çözeltisi 

Deneyin Yapılışı

Deney tüpüne analizi yapılacak örnekten 1 mL alınır. Üzerine 3 ml çözelti C eklenerek oda sıcaklığında 15 dakika bekletilir. Bu sürenin sonunda 0.3 ml Folin-fenol kimyasalı eklenip vortekslenir ve 45 dakika oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. UV spektrofotometrede çözeltilerin 660 nm’deki absorbans değerleri okunarak protein miktarları saptanır.

Standart eğrisi oluşturmak için tüplere örnek yerine konsantrasyonları belli olan standart çözeltiden (BSA)  1’er mL eklenerek yukarıdaki prosedür aynen uygulanır. 660 nm’de absorbans okutularak konsantrasyona karşı absorbans grafiği çizilir. Şahit çözelti için ise yine örnek yerine 1 mL saf su koyularak örnek için uygulanan prosedürün aynısı uygulanır.