Bradford Metodu Ile Protein Tayini Analizi Nasıl Yapılır?

Bradford Metodu ile Protein Tayini

Yöntemin Prensibi

Yöntem, Coomassie Brilliant Blue G-250 boyasının proteinlere bağlanması sonucunda oluşturduğu renkli çözeltilerin 595 nm’de absorbansının ölçülmesi ilkesine dayanır.

Kullanılan Malzemeler ve Cihazlar

• Spektrofotometre
• Spektrofotometre küveti
• Terazi
• Filtre kağıdı (siyah noktalı)
• Huni
• Falcon tüpü (15 mL)
• Mikropipet (100-1000 µl)
• Pipet ucu (mavi)
• Balonjoje (100 mL, 1000 mL)

Kullanılan Kimyasallar

BSA (bovine serum albumin): Stok çözeltiden derişimi 0, 20, 40, 60, 80, 100 mg/L olan standart çözeltiler hazırlanır.

Bradford Reaktifi: 0.1 g Coomassie Brilliant Blue G-250 

 50 mL %95’lik etil alkol
100 mL %85 Fosforik asit 

Yukarıdaki kimyasallar karıştırılarak son hacim saf su ile 1000 mL’ye tamamlanır. Karanlıkta 1 gece karıştırılarak bekletilir. Filtre kağıdından süzülür.      

Deneyin Yapılışı

Deney tüpüne analizi yapılacak örnekten 100 µL örnek konulur. Üzerine hazırlanan Bradford çözeltisinden 5 mL eklenerek 5 dakika beklenir. Bu sürenin sonunda 595 nm’de absorbans değerleri okunur.
Standart eğrisi oluşturmak için tüplere örnek yerine konsantrasyonları belli olan standart çözeltiden (BSA)  1’er mL eklenerek yukarıdaki prosedür aynen uygulanır. 595 nm’de absorbans okutularak konsantrasyona karşı absorbans grafiği çizilir. Şahit çözelti için ise yine örnek yerine 1 mL saf su koyularak örnek için uygulanan prosedürün aynısı uygulanır.