Domateslerde 4-CPA Kalıntı Analizi Nasıl Yapılır?

Domateslerde 4-CPA kalıntı analizi

 

Yöntemin Prensibi

Domateslerde 4-CPA kalıntı analizi yönteminin temel prensibi örneğe uygulanan ön işlemlerin ( hidroliz, ekstraksiyon, ekstraktın temizlenmesi, esterifikasyon) ardından kromotografik (GC-ECD/GC-MS) olarak kalitatif ve kantitatif analizine dayanmaktadır. 

İzlenecek Yollar

Domateslerde 4-CPA saptanabilmesi için kullanılan yöntemin kapsamını belirleyen temel basamaklar aşağıda sıralandığı gibidir.

• Kalibrasyon
• GC kolon performansının saptanması
• Esterifikasyon
• Jel kromatografik elusyon sınırlarının saptanması
• Hidroliz
• Ekstraksiyon
• Ekstraktın temizlenmesi
• Esterifikasyon
• Gaz kromatografik tayin (GC-ECD)
• Doğrulama (GC-MS)

 

Tanımlar

4-CPA : Ariloksialkan asit yapısına sahip olan 4-klorofenoksiasetik asit (4-CPA) bitkilerde büyüme düzenleyici etkiye sahip kimyasal bir maddedir.

Sentetik oksinler içinde yer alan renksiz kristal yapıda bir tozdur.

Molekül ağırlığı : 186.6

Molekül formülü : C₈H₇ClO₃

Erime noktası : 157.15 ^oC

Çözücü : 4-CPA bir çok organik çözücüde hızla çözünmektedir.

NOEL değeri : Mevcut değil.

DI değeri : Mevcut değil.

 

Domates yetiştiriciliğinde etkili sonuç genellikle 20-25 mg/kg konsantrasyondaki 4-CPA çözeltisinin çiçek kümeleri üzerine püskürtülmesi ile alınmaktadır.

 

Kullanılan Alet-Ekipman ve Aksesuarlar

• 50 ml’lik kapaklı balonlar
• 25 ml’lik ölçekli deney tüpleri
• Otomatik pipet
• Karıştırıcı (Vorteks)
• Hassas terazi
• Parçalama makinesi
• Çalkalamalı su banyosu
• Rotary evaporatör
• Jel permeation kromatografi sistemi (Kolon, kolon akış adatörü, peristaltik pompa)
• GC-ECD
• GC-MS

 

Kullanılan Kimyasallar

1. Aseton, ekstra saf, (Merck 1.00013)
2. Diklormetan, ekstra saf, (Merck 1.06049)
3. Etilasetat, ekstra saf, (Merck 1.00864)
4. Sikloheksan, ekstra saf, (Merck 1.02832)
5. n-Heksan, ekstra saf, (Merck 1.04367)
6. Metanol, ekstra saf, (Merck 1.06008)
7. Sodyum hidroksit, ekstra saf, (Merck 1.06498)
8. Sodyum sülfat, anhidroz, ekstra saf, (Merck 1.06643)
9. Sodyum klorür, ekstra saf (Merck 1.06400)
10. Sodyum bikarbonat, ekstra saf, (Merck 1.06323)
11. Sülfürik asit, %95-98, (Merck 1.00713)
12. Asetik asit, glacial, (Merck 1.00063)
13. Bio Beads S-X3, 200-400 mesh, Bio Rad no : 152-2750
14. 4-CPA, standart, Dr. Ehrenstorfer, CAS no : 122-83-3, 11480000
15. Su, bidistile
16. Su, deiyonize
17. 1 N NaOH çözeltisi
18. %20’lik H₂SO₄ çözeltisi
19. %4’lük NaHCO₃ çözeltisi

Etilasetat : Sikloheksan karışımı (1:1, v/v)

Standart Çözeltiler: Stok standart çözelti hazırlanmasında çözücü olarak metanol, metil esteri formundaki satandartlar için ise aseton kullanılır.

4-CPA stok çözeltisi: 10 ng/µl konsantrasyondaki standart çözelti stok çözelti olarak kullanılır.

Bu çözelti metanol ile seyreltilerek 1, 2, 3, 4, 5 ve 10 ng/µl konsantrasyonlarında 4-CPA standart çözeltisi hazırlanır.

 

Deneyin Yapılışı

Metot kalibrasyonu

4-CPA analizlerinde kalibrasyon aralığı 0-10 µg/ml olarak belirlenmiştir.

Bu nedenle, kalibrasyon eğrilerinin hazırlanmasında 1, 2, 3, 4, 5 ve 10 µg/ml 4-CPA konsantrasyonlarına eşdeğer olan 4-CPA ME standart çözeltileri kullanılır.

Standart çözeltiler gaz kromatografik olarak analiz edilerek 4-CPA metil esterlerinin relatif ECD duyarlılıkları saptanır.

Standart kalibrasyon eğrilerinin hazırlanmasında konsantrasyona (µg/ml) karşılık ECD ölçüm sonuçları (Hz) esas alınır.

 

Kolon Performansının Saptanması

Kullanılan kapiler kolon (CP-sil8, 30 m x 0.25 mm ID), öncelikle boş enjeksiyon yapılmak suretiyle, kolondan kaynaklanabilecek olası girişimlerin belirlenmesi amacıyla test edilir. Kolon separasyon etkinliğinin test edilmesi amacıyla sırasıyla 10 ve 10 ng/µl konsantrasyonlarındaki 4-CPA’ye eşdeğer 4-CPA ME çerecek şekilde hazırlanır ve kolona enjekte edilir. Kolonda separasyonun tekrar edilebilirliğinin belirlenmesi için ise 1, 2, 3, 4 ve 5 ng/µl 4-CPA konsantrasyonlarına eşdeğer olan 4-CPA ME standart çözeltilerinden yararlanılır.

 

Esterifikasyon

4-CPA asit formdan ester forma dönüştürülmeleri amacıyla CH₃OH/H₂SO₄ esterifikasyon yöntemi kullanılır. Buna göre, asit formda ve metanol içerisinde hazırlanan standart çözeltinin 2 ml’si 25 ml’lik bir deney tüpüne aktarılır. Üzerine yavaş yavaş konsantre H₂SO₄ ilave edilir ve bir dakika boyunca çalkalanır. Oda sıcaklığında, arasıra karıştırılmak suretiyle 10 dakika bekletildikten sonra esterifikasyon reaksiyonu tamamlanır.

 

Oluşan metil esterin ekstraksiyonu amacıyla tüp içerisine 10 ml su, 2 g NaCl ve 2 ml n-heksan ilave edilir ve tüp içeriği vorteks karıştırıcı kullanılarak 2 dakika kuvvetlice çalkalanır. Fazlar ayrıldıktan sonra, üstte kalan n-heksan fazı pastör pipeti ile alınıp 2 ml’lik örnek şişesine aktarılır. Mümkünse hemen analize alınır ve/veya analiz öncesi (-18 ^oC)’de saklanır.

 

Esterifikasyonun Uygulanabilirliği

Esterifikasyon yönteminin uygulananbilirliğinin test edilmesi amacıyla, 1, 2, 3, 4, 5 ve 10 ng/µl konsantrasyonlarda metanolde hazırlanmış 4-CPA çözeltilerinin esterifikasyonu gerçekleştirilerek elde edilen esterler gaz kromatografik olarak analiz edilir. Böylelikle 4-CPA için 1-10 ng/µl aralığında esterifikasyon yönteminin uygulananbilirliği kontrol edilir.

 

Jel Kromatografik Elusyon Sınırlarının Saptanması

 

Jel Kromatografın hazırlanması (GPC)

Çalışmada, peristaltik pompa, kolon ve mobil faz rezervuarından oluşan yarı sürekli bir sistem kullanılır. Mobil faz karışımı organik çözücülerden oluştuğu için, tüm pompa aksamı , boru-bağlantı elemanları, kolon, organik çözücülere dayanıklı malzemelerden seçilmiştir. Kolon dolgu maddesi (jel) olarak 

 

Bio-Beads S-X3 kullanılmıştır. GPC operason koşulları Çizelge 1’de verilmiştir.

 

Çizelge 1. GPC operasyon koşulları

Pompa	Peristaltik pompa
Kolon	1.0 cm ID X 50 cm, Bio Beads S-X3 dolgulu, 200-400 mesh, dolgu yüksekliği 32 cm
Mobil Faz	Etilasetat : Sikloheksan karışımı (1: 1, v / v)
Akış hızı	2.0 ml / dak
Enjeksiyon şekli	Manuel
Enjeksiyon hacmi	1 ml

 

 

GPC Elusyon sınırlarının saptanması

Jel kromatografik elusyon sınırlarının saptanması amacıyla 10 ng/µl konsantrasyonda metanolde hazırlanmış 4-CPA standart çözeltileri kullanılır. Öncelikle 5 ml standart çözelti bir deney tüpüne aktarılır ve metanolun tamamı azot gazı akımında uzaklaştırılır. Kalıntı 5 ml etilasetat:sikloheksan karışımı (1:1, v/v) ile tekrar çözündürülür. Bu çözelti Bio Beads S-X3 dolgulu jel kolonuna enjekte edilir.

 

Jel kromatografisi çalışma koşulları: Kolon beslemesi 2 ml/dak akış hızında etilasetat:sikloheksan karışımı (1:1, v/v) olmak üzere, eluatlar 5 ml’lik fraksiyonlar halinde, toplam hacim 100 ml olana kadar toplanır. Fraksiyonların analizleri ayrı ayrı gerçekleştirilir. Bu amaçla organik çözücünün tamamı azot gazı akımındaevapore edilir ve kalıntı 2 ml metanol ile tekrar çözündürülür. Daha sonra örneğe esterifikasyon yöntemi uygulanarak esterleştirilmiş örnekler gaz kromatografik olarak analiz edilir.

 

Domates ekstraktının Bio Beads S-X3 dolgulu kolonda jel kromatografik temizlenmesi sırasında, elusyon sınırlarında meydana gelebilecek sapmalar da ayrıca belirlenir.

Bu amaçla 4-CPA kalıntısı içeren 5 ml domates ekstraktı Bio Beads S-X3 dolgulu kolona enjekte edilmiştir. Elusyon sırasında oluşan dört farklı renkteki bant (kirli sarı, turuncu, açık sarı, renksiz) ayrı ayrı toplanarak 4-CPA için analiz edilir.

 

Numune Çalışması

Ön işlemler

 

Derin dondurucudan çıkartılan domates örneği bir süre oda sıcaklığında bekledikten sonra mikserde parçalanır.

Parçalanmış domates örneği oda sıcaklığına ulaşıncaya kadar bekletilir.

 

Hidroliz

 

Domates bünyesinde serbest formda bulunan kalıntının yanısıra bağlı ve/veya konjuge formdaki kalıntının da belirlenebilmesi amacıyla alkali hidroliz yöntemi uygulanır.

Bu amaçla 400 ml’lik bir behere 25 g domates tartılır ve üzerine 60 ml saf su ve 15 ml 1 N NaOH çözeltisi ilave edilir (pH > 10.0). Geri kazanma denemelerinde örneklere uygun miktarda 4-CPA ilavesi gerçekleştirilir. Örneğe ilave edilen 4-CPA miktarları ise domateslerdeki kritik kalıntı düzeyinden (0.5 mg/kg) düşük ve yüksek durumlar gözönüne alınarak 0.0 (kontrol), 0.1, 0.5 ve 1.0 ng/µl olarak belirlenmiştir.

 

Karışım çalkamalı su banyosunda 95 ⁰C’de 2 saat süreyle ısıtılarak hidroliz edilir. Süre sonunda örnek karışımından buharlaşma yolu ile uzaklaşan su kadar bidistile su örneğe ilave edilir.

 

Ekstraksiyon

Alkali hidrolizinin ardından kalıntının ekstraksiyonu gerçekleştirilir. Buna göre hidrolizat yaklaşık 5 ml %20 H₂SO₄ çözeltisi ilave edilmek suretiyle asitlendirilir (pH < 1.0). 200 ml aseton çözeltisi ilave ediltikten sonra karışım homojenizatörde orta devirde 2 dakika süreyle homojenize edilir. Homojenize edilmiş örnek 250 ml’lik ölçü silindirine filtre edilir. Bu aşamada filtratın tamamı değil teorik filtrat hacminin (V_f) %80’i 1000 ml’lik bir ayırma hunisine aktarılarak ekstraksiyonda kullanılmıştır. Bu sayede kalıntı miktarının hesaplanmasında kullanılan formüller basitleştirilmiştir.

 

Teorik filtrat hacmi ilave edilen 200 ml aseton, 15 ml 1 N NaOH çözeltisi, yaklaşık 5 ml %20 H₂SO₄ çözeltisi ile örnekte doğal olarak bulunan suyun toplam hacmidir. Teorik filtrat hacminin hesaplanmasında aseton-su hacim kontraksiyonu göz önünde bulundurulmalıdır. 200 ml aseton ve 100 ml su için bu değer 5 ml’dir. Yani 200 ml aseton ile 100 ml suyun toplam hacmi 295 ml’dir.

 

Ayırma hunisine aktarılan filtrat üzerine V_f / 10 g NaCl ilave edilmiş ve 3 dakika kuvvetlice çalkalanır. Fazların ayrılması için yaklaşık olarak 30 dakika beklenir. Alttaki sulu faz atıldıktan sonra organik faz hacmi (V₀) kaydedilir ve ardından içerisinde V₀ / 10 g anhidroz Na2SO4 bulunan bir erlene aktarılır. Organik faz anhidroz Na2SO4 üzerinde 20 dakika boyunca bekletilerek kurutulur. Süre sonunda organik faz siyah bant filtre kağıdı üzerinden 250 ml’lik bir Rotary balonu içerisine aktarlır. Filtre tabakası 20 ml etil asetat ile yıkanarak Rotary balonuna aktarılır.

 

Ekstraktın temizlenmesi

Organik faz önce jel kromatografik, daha sonra asit-baz partitisyonu ile temizlenmelidir. Jel kromatografik temizleme amacıyla organik faz 40 ⁰C’de Rotary evaparöterde, son hacmi yaklaşık 1 ml olacak şekilde konsantre edilir. Konsantre örnek üzerine 4.5 ml etil asetat eklenir ve hafifçe çalkalanır. Üzerine 4.5 ml sikloheksan ilave edilerek hafifçe çalkalanır. Örnek toplam hacminin yaklaşık %50 si (yaklaşık 5 ml) Bio Beads S-X3 dolgulu kolonuna enjekte edilir. Kolon çıkışından alınan eluat daha önceden saptanan eluat sınırları kullanılarak toplanır.

 

Asit-baz partitisyonu ile temizleme amacıyla jel kromatografi kolonundan toplanan eluat, 15 ml etil asetat:sikloheksan karışımı (1: 1) ile birlikte 100 ml’lik ayırma hunisine aktarılarak 2X 30 ml %4’lük NaHCO₃ ile ekstrakte edilir. NaHCO₃ fazları birleştitildikten sonra 3-4 ml %20’lik H₂SO₄ ilave edilerek asitlendirilir. Bu sırada açığa çıkan CO₂, hafif karıştırmak suretiyle uzaklaştırılır. Asitlendirilmiş NaHCO₃fazları 3 x 20 ml diklormetan ile ekstrakte edilir ve diklormetan fazları birleştirilir.

 

Esterifikasyon

 

Diklormetan ekstraktı, üzeri 1 cm Na₂SO₄ kaplı siyah bant filtre kağıdı üzerinden filtre edilir ve filtre tabakası 2-3 ml diklormetan ile yıkanır. Diklormetanın tamamı 40 ⁰C’de Rotary evaparatör yardımıyla buharlaştırılır. Kalıntı azot gazı akımında tamamen kurutulur ve kurutulmuş kalıntı 2 ml metanol ilave edilerek tekrar çözündürülür.

 

Bundan sonra, asit formda ve metanol içerisinde hazırlanmış standart çözeltinin tamamı 25 ml’lik bir deney tüpüne aktarılır. Üzerine yavaş yavaş konsantre H₂SO₄ ilave edilir ve bir dakika boyunca çalkalanır. Oda sıcaklığında, arasıra karıştırılmak suretiyle 10 dakika bekletildikten sonra esterifikasyon reaksiyonu tamamlanır.

 

Oluşan metil esterin ekstraksiyonu amacıyla tüp içerisine 10 ml su, 2 g NaCl ve 2 ml n-heksan ilave edilir ve tüp içeriği vorteks karıştırıcı kullanılarak 2 dakika kuvvetlice çalkalanır. Fazlar ayrıldıktan sonra, üstte kalan n-heksan fazı pastör pipeti ile alınıp 2 ml’lik örnek şişesine aktarılır. Mümkünse hemen analize alınır ve/veya analiz öncesi (-18 ^oC)’de saklanır.

 

GC-ECD ANALİZİ

 

Hazırlanan çözeltinin analizi gaz kromatografik (GC-ECD) olarak gerçekleştirilir. Bu amaçla örneğin 1 µl’si SE-54 kapiler kolon ve/veya muadili olan bir kapiler kolona enjekte edilir. Kromatografik koşullar Çizelge 2’de verildiği gibidir.

 

Çizelge 2. GC-ECD operasyon koşulları

Gaz Kromatograf	Varian 3800 serisi gaz kromatograf
Dedektör	ECD
Kolon	CPSil-8 (0.25 mm ID x 30 m, 0.25 µm film kalınlığı)
Enjeksiyon bloğu	Split / Splitless
Sıcaklık programı	80 0C (0 dak) 80 0C 250 0C (10 0C / dak) 250 0C (3 dak)
ECD sıcaklığı	300 0C
Enjektör sıcaklığı	250 0C
Taşıyıcı gaz	Azot, %99.999 saflıkta
Toplam gaz akış hızı	95 ml /dak
Gaz akış hızı	2,5 ml /dak (~ 10 psi)
Enjeksiyon hacmi	1 µl

 

Doğrulama

GC-ECD analizi elde edilen sonuçların kalitatif ve kantitatif doğrulaması GC-MS kullanılarak gerçekleştirilir. Buna göre GC-ECD analizi yapılan örneklerin her biri GC-MS kullanılarak analiz edilir. Bu amaçla Agilent 6890 model bir gaz kromatograf, Agilent 5937 model kütle seçici dedektör, Agilent 7683 model otoenjektör-otoörnekliyici entegre sistemi kullnılmaktadır.

 

GC-MS performansının optimizasyonu amacıyla 170 ⁰C’de ototonlama işlemi gerçekleştirilir. Bu amaçla pentaflorotributilamine ait iyonlar (m/z 69, 219, 502) kullanılır. GC-MS operasyon koşulları Çizelge 3’de verilmiştir.

 

Çizelge 3. GC-MS operasyon koşulları

Gaz Kromatograf	Agilent 6890 serisi gaz kromatograf
Dedektör	Agilent 5973 Kütle selektif dedektör
Kolon	HP-5 (0.25 mm ID x 30 m, 0.25 µm film kalınlığı)
Enjeksiyon bloğu	Splitless
Sıcaklık programı	80 0C (0 dak) 80 0C 250 0C (10 0C / dak) 250 0C (3 dak)
Dedektör sıcaklığı	300 0C
Enjektör sıcaklığı	250 0C
Taşıyıcı gaz	He
Toplam gaz akış hızı	95 ml /dak
Gaz akış hızı	2,5 ml /dak (~ 10 psi)
Enjeksiyon hacmi	1 µl
İyonizasyon potansiyeli	70 eV

 

Hesaplamalar

Domatesdeki 4-CPA kalıntı miktarı mg/kg olarak ifade edilir. Hesaplanan kalıntı düzeyleri, ortalama geri kazanma oranları göz önüne alınarak düzeltilir.

Hesaplamada kullanılan eşitlik aşağıdaki gibidir :

(a) Test çözeltisindeki kalıntı konsantrasyonunun hesaplanması

 

C_t = C_S x A_t / A_S veya C_t = A_t b / a

 

Burada ;

C_t = Test çözeltisindeki kalıntının konsantrasyonu, µg/ml

C_S = Standart çözeltinin konsantrasyonu, µg/ml

A_t = Test çözeltisi içindeki kalıntının pik alanı,

A_S= Standart çözeltinin pik alanı,

a = Standart eğrinin eğimi

b = Kalibrasyon eğrisinin y-eksenini kestiği nokta

 

(b) Domatesteki kalıntı miktarının hesaplanması

 

Kalıntı (ppm) = C_t x V_t / m

 

Burada ;

C_t = Test çözeltisi içerisindeki kalıntının konsantrasyonu, µg/ml

V_t = Test çözeltisinin hacmi, ml

m = Test çözeltisinin temsil ettiği örnek miktarı, g

 

 

(c) Düzeltilmiş kalıntı miktarının hesaplanması

 

Düzeltilmiş kalıntı (ppm) = (Kalıntı (ppm) / R ) x 100

 

Burada ;

 

R = Geri kazanma oranı, %

 

 

Dikkat Edilmesi Gereken Noktalar

Çalışma sırasında oluşacak interferanslar kullanılan solventlerde, cam malzemelerde ve diğer örnek hazırlama ve/veya ön işlemlere ait aparatlarda kontaminasyona neden olabilir. Bu nedenle her analizde mutlaka yalnızca çözücünün kullanıldığı bir kör ile okuma yapılmalıdır. Ayrıca dikkat edilmesi gereken noktalar aşağıda verilmiştir :

Cam malzeme mutlaka asitten geçirilmeli, su ile temizlenmeli ve distile sudan geçirildikten sonra kurutularak kullanılmalıdır.

Yüksek saflıkta reagent ve solvent kullanımı interferansları minimize edebilir.

Okumalar sırasında kolonda kalan kirlilik faktörleri nedeniyle oluşacak interferansların giderilmesi için boş okumaların yapılması gereklidir.

Standart okumaları sırasında düşük konsantrasyondan yüksek konsantrasyona doğru okuma yapılmalıdır.

Jel kromotografi düzeneği kurulması aşamasında mobil faz karışımı organik çözücülerden oluştuğu için, tüm pompa aksamı , boru-bağlantı elemanları, kolon, organik çözücülere dayanıklı malzemelerden seçilmelidi